非法添加成分是指在農(nóng)藥制劑中人為添加標稱 有效成分以外的農(nóng)藥成分。 近年來,我國加強了對 有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的管理,對高毒農(nóng)藥全面禁止生產(chǎn)和使用,對等農(nóng)藥限 制在蔬菜、水果等作物上使用。
而有些不法商 家為了增加防治效果、降低登記和生產(chǎn)成本、牟取暴利,在產(chǎn)品中非法添加高毒、禁限用的有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑。 使用含有非法添加殺蟲劑的 農(nóng)藥制劑可能造成農(nóng)藥殘留超標,影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量 安全,導致作物發(fā)生藥害,給農(nóng)民造成經(jīng)濟損失,對 生態(tài)環(huán)境造成污染。 近年來,農(nóng)藥制劑中非法添加 成分已引起各級農(nóng)業(yè)主管部門的高度重視,成為監(jiān)管的重要對象。
我國有超過1100 種農(nóng)藥應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn), 農(nóng)藥制劑中已有的檢測方法主要針對某一種或多種 有效成分的含量檢測,主要有氣相色譜(GC)法 、 液相色譜(LC)法、光譜法等。 非法添加成分 具有很強的隱蔽性和隨機性,常規(guī)的 GC 法和 LC 法 無法應用于非法添加成分的檢測。
目前,文獻報道 的農(nóng)藥非法添加成分的檢測方法有氣相色譜?質(zhì)譜 (GC?MS) 法 、液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜( HPLC? MS / MS)法。 GC?MS 法不適用于難氣化或者高 溫下容易分解的農(nóng)藥,HPLC?MS / MS 法雖然靈敏度 高,選擇性和特異性好,然而不能對化合物進行 相對分子質(zhì)量(Mr)的測定,不能建立標準的質(zhì)譜數(shù) 據(jù)庫,在定性檢測方面尚有一定的欠缺。
超液相色譜?四極桿?飛行時間質(zhì)譜( UPLC?Q?TOF MS)依據(jù)所測得化合物的相對分子質(zhì)量,可以 對化合物進行定性,從而避免誤檢和漏檢 , 并且可以建立標準的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,能夠對未知樣品 進行快速、準確的篩查。 目前,UPLC?Q?TOF MS 廣 泛應用于中成藥和保健品、食品添加劑 、獸藥和水產(chǎn)品等多個領域非法添加成分的 篩查。 作者尚未見到有應用 UPLC?Q?TOF MS 方法 篩查農(nóng)藥制劑中非法添加有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的文獻報道。
本研究建立了可濕性粉劑( WP)、乳油(SC) 3 種農(nóng)藥制劑中 48 種有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲 劑的快速篩查方法,為打擊在農(nóng)藥制劑中非法添加 殺蟲劑提供了有力的。
一、實驗部分
1. 儀器與試劑
Agilent 1290 超液相色譜儀/ 6530 四極桿? 飛行時間質(zhì)譜儀,MassHunter 工作站及定性分析軟 件,PCDL個人譜圖數(shù)據(jù)庫軟件; Zorbax C18柱(100 mm×1.8 mm, 2.1 μm,);超純水機(美國 Millipore 公司)。
甲醇、乙腈為 LC?MS 純試劑,甲酸為色譜純試 劑,實驗用水為超純水。
48 種殺蟲劑單標準溶液的配制:稱取農(nóng)藥標準品 10 mg(至 0.1 mg),置于 25 mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容。
實驗樣品從市場隨機抽取。
2. 液相色譜條件
色譜柱為 Zorbax C18柱;色譜柱溫度為 35 ℃; 進樣量為 1 μL。 流動相:A 相為 0.1% (v / v)甲酸水 溶液,B 相為乙腈;流動相流速為 0.3 mL / min。 梯 度洗脫程序:0 ~ 3.0 min, 10% B~ 40% B; 3.0 ~ 7.0 min, 40% B~ 90% B; 7.0 ~ 12.0 min, 90% B; 12.0 ~12.5 min, 90% B~10% B。
3. 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子(ESI) 源,正離子模式;掃 描范圍:一級質(zhì)譜 m/ z 150 ~ 500,二級質(zhì)譜 m/ z 50 ~500;霧化氣:氮氣;霧化氣流量:11 L / min;噴霧氣 壓力:3.4×10 5 Pa;干燥氣溫度 300 ℃;毛細管電壓:3 500 V;碎裂電壓 140 V;二級質(zhì)譜碰撞能量分別 為:5、10、20 和 40 V。 UPLC?Q?TOF MS 配置了雙 噴霧器電噴霧源,采集數(shù)據(jù)時可以連續(xù)導入?yún)⒈热?液,對儀器質(zhì)量軸進行實時校正,參比離子為 m/ z 121.050 9 和 m/ z 922.009 8。
4. 數(shù)據(jù)庫的建立
4.1 一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立
采用 Agilent 公司的 PCDL 軟件建立了 48 種有 機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。取標準溶液稀釋至 2 mg / L,按照2 和3 節(jié)的液相色 譜和質(zhì)譜條件進樣。 采集一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)(TOF?MS 模式),得到目標化合物的保留時間、質(zhì)量數(shù)等 信息,通過在 PCDL 軟件中輸入每種農(nóng)藥的中英文 名稱、分子式、相對分子質(zhì)量和保留時間,建立 了 48 種殺蟲劑的一級質(zhì)量數(shù)據(jù)庫。
4.2 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立
一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫建立完成后,對 48 種殺蟲劑再 次進樣測定,采集二級質(zhì)譜圖,通過 PCDL 軟件建立 48 種農(nóng)藥的二級質(zhì)譜庫,二級質(zhì)譜庫中包含母離 子、保留時間、不同碰撞能量(5、10、20 和 40 V)下的 二級質(zhì)譜圖等信息。
5. 樣品前處理
我國登記和使用較多的農(nóng)藥制劑有可濕性粉劑、乳油、懸浮劑 3 種劑型,本實驗對不同劑型的樣品分別進行處理。
5.1 可濕性粉劑樣品的處理
準確稱取 0.25 g 樣品置于 25 mL 容量瓶中,加 入 15 mL 甲醇,超聲溶解 10 min,冷卻至室溫。 用 甲醇定容至 25mL,然后轉移到 50 mL 離心管中,以3500 r/ min 的速度離心 5 min,吸取 1 mL 上清液至 10 mL 容量瓶中,加入 4mL 乙腈,用水定容至 10 mL,過 0.22 μm 濾膜后進樣測定。
5.2 乳油樣品的處理
準確稱取 0.25 g 乳油樣品,置于 25 mL 容量瓶 中,用甲醇溶解并定容,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容 量瓶中,加入 4 mL 乙腈,用水定容至 10 mL,過 0.22 μm 濾膜后進樣測定。
5.3 懸浮劑樣品的處理
準確稱取 0.25 g 懸浮劑樣品,置于 25 mL 容量 瓶中,加入 5 mL 水,振搖,使樣品均勻分散在水中。 然后加入 15 mL 甲醇,超聲溶解 10 min,冷卻至室 溫。 用甲醇定容至 25 mL,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中,加入 4 mL 乙腈,用水定容至 10 mL,過 0.22 μm 濾膜后進樣測定。
二、結果與討論
1. 樣品前處理條件的選擇
農(nóng)藥制劑在加工的過程中,會根據(jù)劑型的不同 加入不同的助劑。 所以,根據(jù)劑型的不同,樣品的前 處理方法也略有不同。
可濕性粉劑在加工的過程中需要加入載體(如 硅藻土、高嶺土)和助劑(如潤濕劑、分散劑)等。 在 樣品處理過程中,載體一般不溶解于甲醇,可通過離 心除去。 助劑在甲醇中有一定的溶解性,但不影響對農(nóng)藥的提取。 可濕性粉劑可以直接加入甲醇后超 聲提取。
乳油樣品在加工的過程中加入了大量的有機溶 劑和助溶劑,如甲醇、乙腈、丙酮等溶劑,由于稱取的 樣品量較少,這些溶劑均可以溶解于甲醇中,對樣品 提取沒有影響。
懸浮劑在加工的過程中加入了一些特殊的助劑 如分散劑、潤濕劑等,如直接加入甲醇,樣品容易聚 集,不利于提取。 因此在樣品中先加入 5mL 水,使 樣品均勻分散在水中,再加入甲醇超聲溶解提取。
對于這 3 種劑型的農(nóng)藥制劑,在提取過程中,一 些干擾物質(zhì)如潤濕劑、分散劑等也會被提取到甲醇 溶液中,這些物質(zhì)對分離和測定有一定的影響,但是 由于非法添加殺蟲劑的含量較高,樣品經(jīng)過提取后 需要稀釋才能進樣分析,干擾物質(zhì)也同時被稀釋,從 而減少了對分析測定的影響。經(jīng)過比較,不經(jīng)凈化 處理的樣品對測定基本沒有影響,可直接進樣分析, 從而減少了樣品前處理造成的損失,提高了回收率。
2. 液相色譜條件的優(yōu)化
一般檢測農(nóng)藥常用乙腈?水或甲醇?水兩種混合 溶劑體系作為流動相,首先對這兩種體系作流動相 進行了對比。 結果表明,使用乙腈?水體系做流動相 時,48 種殺蟲劑的色譜峰形較好,峰形對稱,響應值 也高于以甲醇?水為流動相時的響應值,采用乙腈? 水體系的壓力較低,有利于色譜柱的壽命和儀器的 保護。 之后考察了酸對分離和靈敏度的影響,結果 表明,以乙腈?0.1% (v / v)甲酸水溶液為流動相得到 了*的峰形和色譜分離效果。 在流動相中加入 0.1% (v / v)甲酸,有助于提高化合物的離子化效 率,提高靈敏度。 因此選擇以乙腈?0.1%(v / v)甲酸 水溶液作為流動相。
3. 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
采用正離子掃描模式,優(yōu)化了 48 種殺蟲劑的準 分子離子峰,選擇強度大的準分子離子峰可以提高 分析的靈敏度和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索的穩(wěn)定性與得分。 經(jīng)過優(yōu)化,在 ESI +模式下,水胺硫磷[M+Na]+的強 度大于[M+H]+的強度,其余 47 種農(nóng)藥的[M+H]+強度zui大。如表 1 所示,為了實現(xiàn)對 48 種殺蟲劑的 譜庫檢索定性檢測,所獲得的二級質(zhì)譜圖在高質(zhì)量 區(qū)和低質(zhì)量區(qū)的碎片都非常重要,因此,每種殺蟲劑 均獲得 4 個不同碰撞能量下的二級質(zhì)譜圖,在進行 譜庫檢索時,低碰撞能量的質(zhì)譜圖有利于判斷主要 碎片,而高碰撞能量的質(zhì)譜圖可以得到更多質(zhì)譜碎 片信息,能夠更準確地實現(xiàn)對化合物的定性。 根據(jù) 試 驗結果選擇4個碰撞能量( 5、10、20和40 V) ,可以實現(xiàn)每種殺蟲劑在高質(zhì)量區(qū)和低質(zhì)量區(qū)獲得足 夠的質(zhì)譜碎片信息。 48 種農(nóng)藥的準分子離子[M+ H]+或者[M+Na]+的實測 Mr 和通過 Mr 計算軟件 計算出的每種殺蟲劑的理論 Mr 值見表 1。 按照前 述優(yōu)化的條件對 48 種殺蟲劑的混合標準溶液進行 檢測,得到總離子流圖(見圖 1)。
4. 定性分析
先對樣品進行一級質(zhì)譜全掃描,通過一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對采集到的一級質(zhì)譜圖進行自動檢索,軟件 根據(jù)實測離子與數(shù)據(jù)庫中的保留時間、質(zhì)量、同 位素分布和同位素比例等因素的匹配度進行綜合評 分,將檢索得分≥85 的樣品確定為陽性樣品。 再利 用二級質(zhì)譜的碎片離子對陽性樣品進一步確證。 樣 品經(jīng)過二次進樣測定,對陽性樣品中疑似非法添加 的殺蟲劑進行二級質(zhì)譜掃描,將采集到的二級質(zhì)譜 圖通過已建立的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行檢索,根據(jù)離 子精度、同位素比例、同位素豐度等因素進行綜合評 分,將得分≥75 的農(nóng)藥確定為非法添加的殺蟲劑。
為了考察本文所建立的篩查方法對 48 種殺蟲劑篩查結果的可靠性,采用已建立的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對樣品中添加了 48種殺蟲劑 的可濕性粉劑、乳油、懸浮劑樣品進行自動檢索,結果見表 1。
5. 線性關系、定量限、檢出限、回收率和精密度
配制 0.5~20 mg / L 范圍的標準溶液,以化合物 的準分子離子峰作為定量離子,在本文所述的色譜 條件和質(zhì)譜條件下進行測定,以提取離子色譜圖的 峰面積(Y)為縱坐標、質(zhì)量濃度(X, mg / L)為橫坐 標進行回歸分析。 結果表明,48 種殺蟲劑的線性相 關系數(shù)R2 均大于 0.99,說明本方法適用于農(nóng)藥制 劑中 48 種殺蟲劑的定量分析。 對篩查出的非法添 加殺蟲劑進行定量分析時,使用寬度為 20×10 -6(20 ppm)的質(zhì)量偏差對一級全掃描總離子流圖提取離 子色譜圖,采用外標法以提取離子色譜峰的峰面積 進行定量分析。
以定量離子 10 倍信噪比(S / N)的響應值對應 的質(zhì)量濃度為方法定量限(LOQ);以一級質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫檢索得分≥85 和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索得分≥75 的篩查zui低質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD) (見 表 2)。 選擇可濕性粉劑、乳油、懸浮劑空白樣品進 行加標回收試驗,選取 0.5、1.0 和 5.0 mg / kg 3 個添加水平,每個水平重復測定 3 次,48 種殺蟲劑在 3 種劑型中的加標回收率為86.3% ~ 101.5%,相對標 準偏差(RSDs)為 1.7% ~4.0% (見表 2)。
6. 實際樣品的篩查
從上海郊區(qū) 9 個區(qū)(縣)的農(nóng)資門店抽取了 100 份樣品,應用本方法進行快速篩查及含量分析,結果見表 3。 在 100 個樣品中,有9個樣品檢出非法添 加的殺蟲劑,9 份樣品的一級質(zhì)譜檢索得分≥85,二 級質(zhì)譜檢索得分≥75,非法添加成分的含量均大于1%(質(zhì)量分數(shù))。
三、結 論
建立了可濕性粉劑、乳油、懸浮劑等 3 種農(nóng)藥制 劑中 48 種殺蟲劑的 UPLC?Q?TOF MS 篩查方法。 該方法具有快速、定性準確等優(yōu)點,能有效避免樣品 的誤檢和漏檢,可以滿足農(nóng)藥制劑中非法添加成分 的快速篩查和定量要求。 本次抽取的 100 份樣品中 篩查出了我國在蔬菜、水果等作物上禁止或者限制 使用的農(nóng)藥,如、滅多威等,這些農(nóng) 藥使用后,可能引起作物藥害、農(nóng)產(chǎn)品殘留超標等一系列嚴重后果,危害到人民群眾的身體健康和農(nóng)民 的經(jīng)濟利益。 通過對非法添加成分的快速篩查,能 夠從源頭加強農(nóng)藥質(zhì)量的管理,確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和農(nóng)民的利益,為相關的監(jiān)管部門提供。(來源:武漢中昌國研標物科技有限公司)